Kính hiển vi huỳnh quang độ phân giải cao 17.10.2014

Để xem tế bào và nội dung của nó, chúng ta phải dùng kính hiển vi. Nguyên tắc hoạt động của nó tương đối đơn giản: tia sáng đi qua một vật thể rồi đi vào thấu kính phóng đại, để chúng ta có thể nhìn thấy cả tế bào và một số bào quan bên trong nó, chẳng hạn như nhân hoặc ti thể.

Nhưng nếu chúng ta muốn nhìn thấy một phân tử protein hoặc DNA, hoặc nhìn vào một phức hợp siêu phân tử lớn như ribosome, hoặc một hạt vi rút, thì một kính hiển vi ánh sáng thông thường sẽ trở nên vô dụng. Trở lại năm 1873, nhà vật lý người Đức Ernst Abbe đã suy ra một công thức đặt ra giới hạn về khả năng của bất kỳ kính hiển vi ánh sáng nào: hóa ra là không thể nhìn thấy một vật thể nhỏ hơn một nửa bước sóng của ánh sáng khả kiến ​​- tức là nhỏ hơn 0,2 micromet.

Giải pháp, rõ ràng, là chọn thứ gì đó có thể thay thế ánh sáng nhìn thấy. Bạn có thể sử dụng một chùm tia điện tử, và sau đó chúng tôi nhận được một kính hiển vi điện tử - bạn có thể quan sát vi rút và các phân tử protein trong đó, nhưng các đối tượng được quan sát trong kính hiển vi điện tử rơi vào điều kiện hoàn toàn không tự nhiên. Do đó, ý tưởng của Stefan W. Hell từ Viện Hóa lý Sinh của Hiệp hội Max Planck (Đức) hóa ra lại cực kỳ thành công.

Bản chất của ý tưởng là một vật thể có thể được chiếu xạ bằng chùm tia laze, chùm tia này sẽ đưa các phân tử sinh học vào trạng thái kích thích. Từ trạng thái này, chúng sẽ bắt đầu chuyển sang trạng thái bình thường, tự giải phóng khỏi năng lượng dư thừa dưới dạng bức xạ ánh sáng - tức là quá trình phát huỳnh quang sẽ bắt đầu và các phân tử sẽ trở nên nhìn thấy được. Nhưng các sóng phát ra sẽ có độ dài rất khác nhau, và chúng ta sẽ có một điểm vô định trước mắt mình. Để ngăn điều này xảy ra, cùng với tia laser kích thích, vật thể được xử lý bằng chùm tia dập tắt, tia này triệt tiêu tất cả các sóng ngoại trừ những sóng có chiều dài nanomet. Bức xạ có bước sóng theo bậc nanomet chỉ giúp phân biệt được phân tử này với phân tử khác.

Phương pháp này được gọi là STED (suy giảm phát xạ kích thích), và chính vì điều này mà Stefan Hell đã nhận được giải Nobel của mình. Với kính hiển vi STED, vật thể không bị bao phủ hoàn toàn bởi sự kích thích của tia laze ngay lập tức, nhưng nó được vẽ bởi hai chùm tia mỏng (tia kích thích và tia làm dịu), bởi vì diện tích phát huỳnh quang tại một thời điểm nhất định càng nhỏ, thì càng cao độ phân giải hình ảnh.

Sau đó, phương pháp STED đã được bổ sung bằng cái gọi là kính hiển vi đơn phân tử, được phát triển độc lập vào cuối thế kỷ XNUMX bởi hai nhà khoa học đoạt giải hiện nay, Eric Betzig của Viện Howard Hughes và William E. Moerner của Stanford. Trong hầu hết các phương pháp hóa lý dựa vào huỳnh quang, chúng ta quan sát được tổng bức xạ của nhiều phân tử cùng một lúc. William Merner vừa đề xuất một phương pháp mà người ta có thể quan sát bức xạ của một phân tử đơn lẻ. Trong khi thử nghiệm với protein huỳnh quang xanh lục (GFP), ông nhận thấy rằng sự phát sáng của các phân tử của nó có thể được bật tắt tùy ý bằng cách điều khiển bước sóng kích thích. Bằng cách bật và tắt huỳnh quang của các phân tử GFP khác nhau, chúng có thể được quan sát trong kính hiển vi ánh sáng, bỏ qua giới hạn Abbe nanomet. Toàn bộ hình ảnh có thể thu được bằng cách kết hợp một số hình ảnh với các phân tử phát sáng khác nhau trong trường nhìn. Những dữ liệu này được bổ sung bởi ý tưởng của Eric Betzig, người đã đề xuất tăng độ phân giải của kính hiển vi huỳnh quang bằng cách sử dụng các protein có các đặc tính quang học khác nhau (nghĩa là đa màu).

Sự kết hợp giữa phương pháp dập tắt kích thích của Địa ngục với phương pháp áp đặt tổng Betzig-Merner đã giúp phát triển kính hiển vi có độ phân giải nanomet. Với sự trợ giúp của nó, chúng ta có thể quan sát không chỉ các bào quan và các mảnh của chúng, mà còn cả sự tương tác của các phân tử với nhau (nếu các phân tử được đánh dấu bằng protein huỳnh quang), điều mà chúng tôi nhắc lại là không thể luôn luôn bằng các phương pháp kính hiển vi điện tử. Giá trị của phương pháp này khó có thể được đánh giá quá cao, bởi vì sự tiếp xúc giữa các phân tử là điều mà sinh học phân tử đứng trên và nếu không có nó là không thể, chẳng hạn như việc tạo ra các loại thuốc mới, cũng không giải mã các cơ chế di truyền, cũng như nhiều thứ khác nằm trong lĩnh vực khoa học và công nghệ hiện đại.